常用蛋白质浓度测定方法汇总

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常用蛋白质浓度测定方法汇总


 蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一,承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础。目前常用的蛋白测量的方法主要有BCA法、考马斯亮蓝法(Bradford)和Lowry法等。


  BCA法  

 原理

 在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+(biuret reaction)。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。


实验步骤

1.按试剂盒说明书配置BCA工作液;

2.完全溶解蛋白质标准品,加到96孔板的蛋白标准品孔中,按照说明书要求对标品进行梯度稀释,加入BCA工作液,用酶标仪测定其吸光度;

3.以样品浓度为X轴,吸光度为Y轴,绘制标准曲线;

4.待测样品中加入BCA工作液,测定吸光度,带入标准曲线中,计算样品浓度。

  与Lowery法相比,BCA蛋白测定方法灵敏度高,操作简单,试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳,并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比,BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。


  考马斯亮蓝法(Bradford)法  

 原理

 考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。


实验步骤

1.按试剂盒说明书配置Bradford染液;

2.完全溶解蛋白质标准品,加到96孔板的蛋白标准品孔中,按照说明书要求对标品进行梯度稀释,加入染液和染料结合液后,用酶标仪测定其吸光度;

3.以标品浓度为X轴,吸光度为Y轴,绘制标准曲线;

4.各孔中加入染液和染料结合液,测定样品吸光度,带入标准曲线中,计算样品浓度。

 Bradford法试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,最小可测2。5μg/mL蛋白质。


   斐林—酚试剂(Lowry)法   

 原理

 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应,其中包括两步反应:第一步是在碱性条件下,与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物;第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原,生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物,颜色深浅与蛋白含量成正相关,在650nm波长下有最大光吸收。


 实验步骤

 与上述两种方法大致相同

 LORRY法灵敏度高,重复性好,适于5~l00μg蛋白质的定量,耗时长,操作要严格计时,在实验中要特别注意排除还原物质、柠檬酸等的干扰作用才能得到最准确的实验结果。

 这几种方法共同点在于,都需要绘制标准曲线,而标准曲线及待测样品往往数量较多,为了缩短实验耗时,保证测量准确性,可使用酶标仪对吸光度进行测定。


 AMR-100酶标仪

AMR-100酶标仪

 AMR-100酶标仪是一款基于滤光片的高品质光吸收酶标仪,波长范围340nm~750nm,适合科研和临床的应用。适用96孔板,可满足不同通量的要求。7英寸触屏液晶显示,易于使用,不需操作键盘,数据和程序可保存在仪器内,或者通过U盘导出。读板速度快,能实现快速测量,提供准确性高,重现性好的测量结果。是实验室酶标仪的理想选择。

 性能指标
 显示 7英寸彩色触摸屏,分辨率为800*480像素
 光源 卤钨灯,寿命可达2000h
 波长范围 340-750nm,覆盖整个可见光波长
 滤光片 8片滤光片轮,标配4块滤光片:405,450,492,630nm,另可选配340nm-750nm波长滤光片
 滤光片带宽 ±3nm
 读数范围 0-4。000Abs
 线性范围

0-2.000A时≤±1% ;
2.000-4.000A时≤±2% 

 分辨率 0.001Abs
 准确性(405nm) ±1% (0-3Abs)
 ±2%(3-4Abs)
 精确性(405nm)

CV≤0.2%(0-3Abs)
CV≤1.0%(3-4Abs)标准测量模式

测量速度<6S 96孔板整板检测
用户界面内置软件
操作显示触屏输入,液晶显示全板信息,可外接键盘鼠标
内存可存储200个测量程序和10万个测量结果(96孔板)
接口3个USB接口,分别用于连接电脑,打印机和U盘
电源AC100-240V,50-60Hz


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此文关键词:酶标仪
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